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      公司公告

      天昊微生物項目文章:紅曲菌發酵的蕎麥通過調節肝臟代謝物和腸道微生物來預防血脂異常和非酒精性脂肪肝

      發稿時間:2020-12-08來源:天昊生物



      紅曲菌發酵米在中國和其他亞洲國家用于治療消化系統疾病和促進血液循環已有幾個世紀了。然而,紅曲菌發酵蕎麥(HQ)對非酒精性脂肪肝(NAFLD)和血脂異常的影響及其機制尚不清楚??诜t曲菌發酵蕎麥(HQ)能顯著抑制高脂高膽固醇飼料(HFD)小鼠體重和附睪白脂肪組織(eWAT)的異常生長,防止附睪脂肪細胞肥大,改善血清和肝臟與脂質代謝有關的生化指標。組織學分析還表明,添加HQ可顯著減輕HFD喂養引起的肝臟脂質滴過多積聚。微生物組分析顯示,添加HQ對喂飼HFD的小鼠腸道菌群結構有顯著影響。Spearman相關分析顯示,生理指標、血清和肝臟脂質譜與Bacteroidales S24-7、Streptococcus、Allobaculum、Clostridiales XIII呈正相關,但與Lactobacillus、Ruminococcaceae_NK4A214 group、Ruminiclostridium、Alistipes呈負相關?;?/span>UPLC-QTOF/MS的肝臟代謝組學研究表明,HQ干預對初級膽汁酸生物合成、嘧啶代謝、乙醚脂質代謝、谷胱甘肽代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等代謝途徑具有顯著的調控作用,HQ干預可調節肝臟脂質代謝和膽汁酸穩態相關基因的mRNA水平??偟膩碚f,這些發現提供了新的證據,支持HQ通過調節HFD誘導的高脂血癥小鼠的腸道微生物群和肝臟代謝物譜來改善血脂異常和NAFLD。




      紅曲菌屬包含三個著名的物種(M.purpureus、M.ruber和M.pilosus),它們通常用于大米發酵生產紅曲米(RYR)。幾個世紀以來,紅曲米(RYR)一直被中國和其他國家視為具有促進循環作用的膳食補充劑和傳統藥物。隨機安慰劑-對照研究已證明,膳食補充紅曲米可顯著降低低密度脂蛋白膽固醇(24%-27%)(LDL-c)和非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-c)。一般來說,對于不能耐受其他降脂藥物的患者,它是一種可接受的替代品。紅曲菌可以利用底物產生大量的生物功能代謝產物,包括紅曲色素、莫納可林、γ-氨基丁酸、二聚體酸、酶、多糖、麥角甾醇、聚酮類、不飽和脂肪酸、植物甾醇、異黃酮、生物堿、微量元素等。另一方面,蕎麥(Fagopyrum esculentum Moench.)含有多種黃酮類化合物、大量蛋白質、平衡氨基酸、纖維、維生素B1和B2、鋅、銅、錳和硒。最近的研究表明,紅曲發酵可以提高發酵基質中多酚或類黃酮的含量。例如,發酵后燕麥的酚類成分和抗氧化活性均顯著提高。紅曲菌GIM-3.592與釀酒酵母GIM-2.139共發酵可顯著提高番石榴葉總多酚含量和抗氧化能力。另外,紅曲菌發酵泰國糯米能降低飲食誘導的高膽固醇血癥大鼠血液和肝臟膽固醇及脂肪肝變性的濃度。最近,Hong等人報道了紅曲霉發酵的蕎麥可以通過降低脂肪生成特異性基因表達并在G1 / S中期導致細胞周期停滯來抑制3T3-L1細胞的脂肪生成。然而,紅曲霉發酵的普通蕎麥(HQ)對體內血脂異常和NAFLD的改善作用和保護機制尚不清楚。越來越多的證據表明腸道微生物群參與了肥胖和肥胖相關并發癥的發生,如血脂異常、NAFLD、胰島素抵抗和T2DM。此外,腸和肝在代謝功能上有著內在的聯系和強烈的相互依賴性。腸肝循環紊亂,包括腸道通透性增加和微生物紊亂,與血脂異常和NAFLD的發生密切相關。先前的一項研究發現,在非酒精性脂肪肝(NAFLD)中,由HFD喂養引起的腸道通透性和微生物紊亂可能導致代謝失衡和先天性免疫系統激活。近年來研究表明,蕎麥的抗性淀粉能改善HFD誘導的高脂血癥小鼠腸道微生物紊亂,特別是促進大腸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌和SCFAs的豐度,但抑制大腸桿菌的生長。但其對肝臟脂質代謝的改善作用及其與腸道菌群的關系尚需進一步探討。隨著代謝組學分析技術和先進軟件的發展,UPLC-QTOF/MS以其較高的重現性、分辨率和靈敏度被證明適合于代謝組學研究,并在食品和營養研究領域得到越來越多的應用。以往的研究已經證明了UPLC-QTOF/MS在高脂血癥相關血清代謝組學研究中的優勢,發現血清中的脂肪酸、氨基酸、膽汁酸等代謝產物參與了高脂血癥的發生。例如,基于UPLC-QTOF/MS的血清代謝組學研究表明,植物乳桿菌NCU116通過調節氨基酸、膽汁酸、脂肪酸和葡萄糖的代謝途徑改善高脂血癥。眾所周知,NAFLD來源于肝細胞內不同種類的脂質的積累,這種積累是由過量的游離脂肪酸輸送到肝臟、增加新生脂肪生成、減少脂肪酸β-氧化和膽汁酸(BAs)排泄所驅動的。迄今為止,紅曲米(RYR)的大部分有益作用和藥理特性已在體內外報道,但基于UPLC-QTOF/MS的肝臟代謝組學研究紅曲菌發酵蕎麥改善血脂異常和NAFLD的機制卻鮮有報道。本研究旨在通過腸道微生物組的高通量測序和基于UPLC-QTOF/MS的肝臟代謝組學研究紅曲菌發酵蕎麥HQ對NAFLD伴血脂異常的保護作用及其機制。揭示了脂肪代謝表型與腸道菌群的關系,為開發抗高脂血癥和NAFLD的功能性食品提供理論依據。



      樣品制備


      在福建農林大學食品生物技術實驗室配制了紅曲菌發酵的普通蕎麥(HQ),詳細步驟具體如下:用0.85%NaCl收獲紅曲孢子懸浮液(5×106個孢子),接種于250mL錐形瓶中,培養基中添加20g蕎麥(調整初始含水量為46%v/w))、0.54%果糖、0.1%MgSO4·7H2O、0.25%·KH2PO4、0.06%NHCl,在30℃培養10天。發酵結束后,將發酵產物干燥研磨成粉末,并在-20°C下儲存。為了消除桔霉素,還對浸泡在去離子水(1:15,g/mL)中的粉末進行輕微攪拌,同時在室溫下將pH調至2.0,保持1h,并將殘留物保持在-20°C以備進一步研究。用UPLC-QTOF/MSESI+)鑒定了紅曲菌發酵蕎麥70%乙醇提取物的主要生物活性成分(圖S1和表S1)。

      動物與飲食

      40只無特異性病原體(SPF)雄性小鼠(6周齡)在標準環境(溫度24±1℃,相對濕度55±5%,光/暗周期12h)中飼養,可自由獲得食物和水。馴化1周后,將小鼠隨機分為4組(n=8),共8周:(1 NFD組:給予正常脂肪飼料(NFD,10%脂肪能量);(2HFD組:高脂高膽固醇飲食(HFD,45%脂肪能量);(3HFD+Simv組:高脂高膽固醇飲食加辛伐他汀干預(15mg/kg/d);(4 HFD+HQ-L組:高脂高膽固醇飲食加低劑量紅曲菌發酵蕎麥干預(200mg/kg/d);(5HFD+HQ-H組:高脂高膽固醇飲食加高劑量紅曲菌發酵蕎麥干預(1000mg/kg/d)。實驗期間,連續8周每周測量每只小鼠的體重(BW)。

      樣品收集

      實驗結束后,小鼠進行通宵禁食,將每只小鼠的新鮮糞便樣本收集到2ml滅菌試管中,在液氮中速凍后于-80℃保存。通過眼睛或心臟采集血液,放入1.5ml離心管中,置于室溫下1小時。采用頸椎脫位法處死小鼠,血清以3000轉離心10min,于-80℃保存。立即切開附睪脂肪和肝臟,稱重,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗,并在液氮中速凍并儲存在-80°C。

      血清和肝臟樣品的生化分析

      血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)和肝臟中的TC、TG水平由全自動生化分析儀測定。采用生化指標試劑盒測定肝臟總膽汁酸(TBAs)和非酯化脂肪酸(NEFA)水平。

      組織病理學評價

      新鮮附睪脂肪組織和肝臟標本在4%多聚甲醛中固定過夜,石蠟包埋,切成5μm厚的切片,用蘇木精和伊紅染色,用配有數碼相機系統的光學顯微鏡在100、200400倍放大率下觀察。

      糞便SCFAs和BAs的測定

      8周后,將單獨籠養鼠的新鮮糞便樣本收集到2ml滅菌管中,并在-80℃下儲存。使用毛細管氣相色譜法對糞便樣品中的SCFAs進行定量分析。使用商業試劑盒以酶法測定糞便中總膽汁酸(TBAs)的濃度。

      基于UPLC-QTOF-MS的肝臟代謝組學研究

      將肝臟樣品(25 mg)和含有內標物(L-2-氯苯丙氨酸,2μg/mL)的提取液(乙腈:甲醇:水=2:2:1)(1000μL)混合,然后均質、超聲和離心。上清液在真空濃縮器中于37℃下干燥。然后,將干燥樣品在200μL 50%乙腈中重組并離心10分鐘,上清液用于UPLC-MS/MS分析。原始UPLC-QTOF/MS數據由MassLynx 4.1處理。用VIP值和雙尾t檢驗的p值(VIP>1.0p<0.05)篩選潛在的生物標志物。通過與Human Metabolome Database數據庫(http://hmdb.ca/)比對,通過精確分子質量和MS/MS片段對生物標志物進行鑒定。肝臟生物標志物的路徑分析在MetaboAnalyst網站上進行(http://www.metaboanalyst.ca/)。

      腸道微生物群高通量測序分析

      用試劑盒提取糞便中總細菌DNA,由上海天昊生物科技有限公司進行16S rRNA擴增子測序(V3-V4。

      qRT-PCR檢測

      RNAiso Plus試劑從保存的冷凍肝組織中提取總RNA,將每個樣本的總RNA反轉錄為cDNA。按表1列出的引物進行qRT-PCR檢測


      HQ干預改善體重參數,減少脂肪堆積

      在脂肪沉積方面,我們觀察到脂肪沉積對小鼠體重的影響在任何一周的HFD小鼠中(+1.5%)和脂肪沉積(脂肪細胞)均無明顯增加(p<0.01)。HQ干預降低了HFD喂養小鼠的體重增加(HQ-L:-13.19%;HQ-H:-43.05%)和附睪脂肪堆積(HQ-L:-65.42%;HQ-H:-63.66%),呈劑量依賴性(圖1A)。高脂血癥小鼠脂肪細胞直徑明顯大于其他實驗組(圖1B)。脂肪組織的擴張促進脂肪細胞功能紊亂和甘油三酯水解增加,這與甘油三酯和脂肪酸在肝臟中的積累密切相關。然而,HQ和辛伐他汀治療使HFD小鼠附睪脂肪細胞的大小減小。與HFD組相比,HFD+Simv、HFD+HQ-LHFD+HQ-H組小鼠的附睪脂肪細胞較?。▓D1B)。