喜訊！天昊SSRSeq新技術揭示蘿卜種質資源種間和種內遺傳變異及系統發育關系

發稿時間：2021-12-23來源：天昊生物

近日，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所領銜，南京農業大學、浙江省農業科學院蔬菜研究所和上海天昊生物參加，在著名生物學期刊《Biology》發表了題為“SSR-Sequencing Reveals the Inter- and Intraspecific Genetic Variation and Phylogenetic Relationships among an Extensive Collection of Radish (Raphanus) Germplasm Resources”的研究論文。該研究利用天昊生物SSR基因分型SSRSeq^TM專利技術，對939份蘿卜種質資源種間和種內的遺傳變異及系統發育關系進行了系統的研究。

發表時間：2021年11月30日

影響因子：5.079（JCR: Q1）

蘿卜是十字花科的一個重要屬，經歷了漫長的進化過程。然而，種間和種內的系統發育關系和遺傳多樣性還不清楚。為了闡明這些問題，研究者對939份野生、半野生和栽培種質進行了SSR測序，分析發現歐洲作為蘿卜的起源中心，有多種野生蘿卜，遺傳多樣性豐富；歐洲、南亞和東亞可能是三個獨立的栽培蘿卜演化中心。在歐洲栽培蘿卜中存在相當大的遺傳分化。歐洲原始栽培蘿卜與黑蘿卜/油蘿卜和鼠尾蘿卜之間存在基因流。在亞洲栽培蘿卜中，南亞的鼠尾蘿卜是東亞中國大蘿卜(包括日本野生蘿卜)分支的姊妹變種，這表明它們可能有最近的共同祖先。日本野生蘿卜與日韓大蘿卜、油蘿卜、鼠尾蘿卜之間有較強的基因交流。美國野生蘿卜是由歐洲野生蘿卜和歐洲櫻桃蘿卜自然雜交演化而成。這些結果均表明，歐洲原始栽培型、美國野生蘿卜和日本野生蘿卜可能在蘿卜進化中發揮了不可或缺的作用。本研究為蘿卜的起源、進化和遺傳多樣性研究提供了新的視角，有利于蘿卜種質資源的保護和開發。

蘿卜屬種類繁多，變異豐富，可分為栽培蘿卜（Raphanus sativus L. 2n=18）和野生蘿卜（Raphanus raphanistrun L. 2n=18）兩個種。其中，分類明確的野生蘿卜包括2個變種，而栽培蘿卜分為5個變種，在世界范圍內廣泛種植。遺傳多樣性是蘿卜進化和分化的基礎。前人利用多種分子標記方法對蘿卜種質資源的親緣關系和分類進行過研究，但大都基于來源有限的栽培材料，很少關注基因多樣性及其分布。SSR又叫微衛星DNA（Microsatellite DNA），由2-6個堿基作為基元，重復串聯組成DNA序列，分布于整個基因組中的編碼與非編碼區域。由于重復性好、多態性高、共顯性遺傳、基因組中含量豐富且覆蓋性較高等特點，不僅可用于種質資源遺傳多樣性分析和親緣關系鑒定，確定其分類地位；同時還可以用于鑒別雜合子和純合子，在雜交品種的種子純度和真偽性鑒定方面具有明顯的優勢。但是傳統的SSR檢測方法存在不足，例如瓊脂糖凝膠電泳，具有便宜、操作方便，分辨率一般大于20bp，但DNA需要量大、分辨率低，片段相差小于20 bp時，結果不可靠。聚丙烯凝膠電泳分辨率優于瓊脂糖凝膠，8%-10%的聚丙烯酰胺凝膠可以檢測10-20bp差異以上的PCR產物，但操作比較繁瑣，易出現漏膠，梳齒不齊等現象。兩種傳統SSR檢測方法結果判讀，都容易受條帶不齊、背景模糊、泳帶拖尾現象的影響，造成鑒定效果不理想，分析效率低。熒光毛細管電泳分辨率高于傳統電泳方法，但是價格較貴，易出現假陽性，只能判斷產物長度差異，無法檢測SSR位點重復單元數。采用天昊生物開發的基于二代高通量測序平臺的SSRSeq^TM技術檢測SSR擴增產物，彌補了傳統SSR檢測方法的不足，具有費用較低、通量大、效率高、分辨率高，精確到單堿基，SSR產物判讀結果準確等優點。本研究以蘿卜全基因組為基礎，設計了覆蓋9條染色體的38對核心SSR引物，對939份蘿卜種質進行了SSRSeq^TM技術分析?；?/span>SSR標記的多樣性，進一步分析了蘿卜的遺傳多樣性和系統發育關系。研究結果為闡明蘿卜遺傳多樣性分布、起源和進化軌跡提供了有價值的信息，為蘿卜有效的種質收集和保存、優質基因挖掘和遺傳改良奠定了良好的基礎。

本研究所用的939份栽培和野生蘿卜材料保存在中國國家蔬菜種質中期庫中，收集自中國31個省和日本、韓國、泰國、印度、德國、俄羅斯、西班牙、法國和美國等國家。野生資源包括兩個亞種。栽培種質資源包括黑蘿卜、櫻桃蘿卜、鼠尾蘿卜、油蘿卜、東亞栽培蘿卜(EACR)(包括中國大蘿卜和日韓大蘿卜)和歐洲原始栽培蘿卜(EPCR)。本研究基于對蘿卜全基因組序列信息的分析，設計了600對分布于蘿卜全基因組的SSR引物。經聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選和毛細管電泳確認，獲得38對高度穩定的多態性SSR引物。這些引物相對均勻地分布在9條蘿卜染色體上。通過對各樣本目標SSR區段的高通量測序，檢測SSR重復序列長度差異和重復單元數以及頻率的不同。結果顯示，該方法的應用能夠準確、高效地對國內、外收集保存的939份蘿卜種質資源的遺傳變異進行鑒定，并能很好地顯示它們之間的演化關系和分類地位。利用本發明提供的38對SSR引物和多重PCR反應體系，結合SSRSeq^TM技術，為蘿卜種質資源的收集、保存、鑒定、分類、挖掘和創新，以及育種材料的遺傳背景鑒定和分子標記輔助育種等研發工作提供了分子層面的有效支持。

圖4、不同栽培蘿卜和野生蘿卜群體間的基因流。條形圖的顏色表示遷移權重，箭頭表示基因流動的方向。

綜上所述，本研究首次利用蘿卜全基因組38對核心SSR引物對939份蘿卜材料的遺傳變異進行了有效鑒定。遺傳多樣性分析顯示，歐洲野生蘿卜群體（EWR）的遺傳多樣性最高，表明歐洲是蘿卜的起源地。歐洲原始栽培類型（EPCR）、中國大蘿卜（CBR）和日韓大蘿卜（JKBR）群體的遺傳多樣性相對較高，其次是油蘿卜（OR）、鼠尾蘿卜（RTR）和櫻桃蘿卜（ESR），這表明歐洲、南亞和東亞可能是獨立的蘿卜馴化中心。系統發育分析、群體結構分析和PCoA分析的結合有效地區分了EWR和栽培蘿卜群體，并表明了野生種和栽培種各亞種或變種之間的遺傳關系?；蛄鞣治鲞€表明，AWR是ESR和野生蘿卜的后代。本研究對蘿卜的遺傳多樣性及其分布、起源和演化有了一個全面的了解。研究結果將有助于蘿卜種質資源的深入研究和利用。

SSRSeq^TM技術能高通量精準鑒定各SSR位點重復序列及其單元數，可以有效地應用于蘿卜種質資源的遺傳多樣性分析和親緣關系研究，對于探索種質資源的背景信息、進行分類和遺傳改良研究以及保護育種者的知識產權具有很高的價值。